ИНСТРУКЦИЯ по применению набора антигена и контрольной позитивной сыворотки для серологической диагностики алеутской болезни норок из штамма «П-1» в РИЭОФ.
(организация-производитель: ЗАО НПВ и ЗЦ фирма «Ветзвероцентр», г. Москва)

I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
1. Набор антигена и контрольной позитивной сыворотки
для серологической диагностики алеутской болезни норок из штамма «П-1» в РИЭОФ (diagnosticum morbus aleutica lutreolarum ).
2. В состав набора входят иммуноспецифические и неспецифические компоненты.
Иммуноспецифические компоненты:
- антиген, приготовленный из штамма «П-1» (с активностью в РИЭОФ 1:4) - 1 флакон (25см3 - 2500 тест-доз);
- контрольная позитивная сыворотка (с активностью в РИЭОФ 1:64) – 1 флакон (1см3 - 100 тест-доз);
Неспецифические компоненты:
- набор компонентов для приготовления 1 дм3 буфера (бура -7,65г., борная кислота - 3,52г.) -1 пакет;
- агароза (7,5г.) - для приготовления 0,75%-го агарозного геля - 1 пакет.
3.По внешнему виду иммуноспецифические компоненты представляют собой: антиген - коричневую прозрачную жидкость, сыворотка - прозрачную или слегка опалесцирующую бесцветную жидкость.
Неспецифические компоненты набора представляют собой порошок белого цвета.
4. Иммуноспецифические компоненты расфасованы в стеклянные флаконы вместимостью 25см3 и 10см3: антиген - по 25см3, сыворотка - по 1,0см3. Флаконы герметично укупорены резиновыми пробками и обкатаны алюминиевыми колпачками.
Неспецифические компоненты расфасованы в пластиковые пакеты и герметично закрыты.
5. На флаконы и пакеты с каждым компонентом наклеивают этикетки с указанием: наименования организации-производителя и (или) ее товарного знака, название компонента, объема или веса, номера серии, контроля, даты изготовления (мес., год) и количество тест доз.
Флаконы и пакеты с компонентами набора упаковывают в картонные коробки с наличием гнезд или перегородок, обеспечивающих целостность препаратов.
На каждую коробку с набором наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование и (или) товарный знак организации-производителя, наименование набора, перечень и количество его компонентов, номер контроля и серии, дату изготовления (мес., год), срок годности, условия хранения, обозначение СТО стандарта, знак соответствия в системе сертификации ГОСТ Р и надпись "Для животных".
В каждую коробку вкладывают инструкцию по применению набора.
Набор рассчитан для исследования 2500 проб сывороток крови норок.
6. Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения исследований по мере поступления биологического материала.
7. Срок годности набора 12 месяцев с даты изготовления при условии хранения в сухом защищенном от света месте при температуре от 2 до 8оС.
Набор по истечении срока годности к применению не пригоден.
8. При нарушении целостности и укупорки флаконов и пластиковых пакетов, изменении цвета компонентов, наличии плесени и посторонних примесей, при отсутствии этикеток, в пределах срока годности их выбраковывают и утилизируют путем автоклавирования при 121оС в течение 40мин.

II. ПРИНЦИП РЕАКЦИИ
9. Принцип диагностики с помощью РИЭОФ заключается в том, что под действием электрического поля в буферном растворе антиген перемещается к положительному полюсу, а антитела - к отрицательному, образуя в месте соприкосновения полосу преципитации в агарозовом геле.
10. На образование линии преципитации влияют: состав и рН буфера, температура постановки реакции.

III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
11. Набор предназначен для обнаружения в реакции иммуноэлектроосмофореза (РИЭОФ) специфических антител к вирусу алеутской болезни норок в сыворотках крови норок. Положительная реакция является основанием для установления окончательного диагноза на алеутскую болезнь. Для постановки РИЭОФ используют:
- прибор для электрофореза «ПЭФ-3», «ЭФ-2»;
- вакуумный насос с электродвигателем;
- осветитель «ОИ-19»;
- столик с уровнем;
- весы ВЛК -500 по ГОСТ 24104;
- пробойник диаметром 2,5мм, с резиновой трубкой;
- стеклянные пластинки 8x15 см;
- направляющую пластинку из оргстекла;
- пипетки градуированные объемом 10-25см3;
- пастеровские пипетки по ГОСТ 25336;
- натрий хлористый по ГОСТ 4233;
- посуду мерную лабораторную;
- капилляры стеклянные;
- кюветы эмалированные;
- фильтровальную бумагу по ГОСТ 12076;
- рН –метр.

Приготовление рабочих растворов
12. Для приготовления борно-боратного буферного раствора с рН 8,6-8,9
содержимое пакета с компонентами для буфера растворить в 1000 см3 дистиллированной воды. Раствор рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8оС в течение 2 месяцев.
13. Для приготовления 0,75%-го агарозного геля содержимое пакета с агарозой растворяют в 1000см3 борно-боратного буферного раствора, заранее смешанного 1:1 с дистиллированной водой, и помещают в колбу объёмом 1000см3. Затем данную смесь нагревают на водяной бане до полного растворения агарозы. На чистую обезжиренную стеклянную пластинку размером 8x15 см наносят 30 см3 горячего раствора агарозы. После застывания в агарозном геле делают лунки при помощи пробойника, соединенного трубкой с вакуумным насосом. Всего на гелевой пластинке делают 206 лунок с таким расчетом, чтобы получилось 10 полных горизонтальных рядов и одиннадцатый нижний не полный (для контроля) с шестью лунками, размещенными парами слева, справа и в середине ряда. Диаметр лунок должен быть 2,5мм, глубина 2,5мм, фактический объем около 0,01см3, расстояние между центрами соседних лунок каждого горизонтального ряда 6мм. Лунки размещают на расстоянии 1 см от края пластинки. Для более точного расположения лунок используют заранее размеченную миллиметровую бумагу, которую кладут под стеклянную пластинку, или накладывают направляющую пластинку из оргстекла с просверленными для пробойника отверстиями.
После разлива агарозы, пластинки должны храниться во влажной камере. Используются пластинки в течение 18 часов после приготовления.
Подготовка биологических материалов.
14. Стеклянные капилляры с кровью, взятой у норок и закрытые с одного
конца пластилином, центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 5 минут.

Постановка и учёт результатов.
15. Постановка РИЭОФ. Отцентрифугированную сыворотку вносят в лунку четного вертикального ряда. Для контроля реакции в четные лунки 11 горизонтального неполного ряда вносят положительную контрольную сыворотку. Антиген вносят во все лунки нечетных вертикальных рядов (включая и контрольные).
Пластинки помещают в камеру для электрофореза так, чтобы ток проходил параллельно горизонтальным рядам, и положительный полюс был справа (со стороны крайнего вертикального ряда с сывороткой). К краям пластинки прикрепляют фильтровальную бумагу, сложенную в 4-5 раз, и опускают их свободные концы в ванны, наполненные на 2/3 объема буферным раствором.
Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока. Сила тока должна быть 10-15 миллиампер, напряжение на выходе - 120-220В. Требуемые параметры тока (по показаниями приборов выпрямителя) достигается путем изменения количества полосок фильтровальной бумаги, если регулировка тумблером не приводит к желаемому результату.

Учет результатов реакции
16. Результаты РИЭОФ предварительно учитывают через 15-45 минут. Линии преципитации наблюдают на тёмном фоне в направленном луче света.
Положительная реакция РИЭОФ характеризуется наличием тонкой прямой линии преципитации в горизонтальных рядах геля на середине между лунками с сывороткой и антигеном. Расплывчатые полосы в геле, диффузные или ограниченные изменения его прозрачности, а также отсутствие изменений расценивается как отрицательный результат.
Окончательную читку реакции проводят после экспозиции стекла с гелевой пластинкой в гипертоническом растворе (12,5%) хлористого натрия в течение 7- 10 минут для удаления неспецифических полос сывороточного белка и последующей выдержкой пластинки в дистиллированной воде не менее 12 часов.
При обнаружении едва различимой линии преципитации результат РИЭОФ считается сомнительным. В этом случае реакцию ставят повторно с новой пробой сыворотки. Подтвержденный сомнительный результат РИЭОФ считается как положительный.
Показания РИЭОФ признают действительным, если на данной пластинке в 11 горизонтальном ряду в контролях будет ясно выражена линия преципитации.
Интерпретация полученных результатов
17. Результат РИЭОФ оценивают как положительный, если между лунками с исследуемой сывороткой и антигеном наблюдают полосу преципитации.
Отсутствие полосы преципитации свидетельствует о том, что испытуемая сыворотка не содержит антител к вирусу АБН.
Положительный результат РИЭОФ указывает на заражение норок алеутской болезнью и на необходимость изолированного их содержания до момента убоя.

IV. MEPЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ
18. При порезах рук стеклом, первую помощь оказывают согласно общепринятым методикам.
19. Работу с химическими компонентами набора следует проводить очень осторожно. При попадании их на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промывать пораженное место большим количеством водопроводной воды под краном.
20. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора.
21. Набор следует хранить в местах, не доступных для детей.
Инструкция по применению разработана организацией-производителем ЗАО НПВ и ЗЦ фирма «Ветзвероцентр», 129337, г. Москва, Хибинский проезд, д.2
Рекомендовано к регистрации в Российской Федерации ФГУ «ВГНКИ».
Регистрационный номер - ПВР-1-4.1/00817

 
Производитель: ЗАО ФИРМА НПВ и ЗЦ ВЕТЗВЕРОЦЕНТР. Россия,129337, г.Москва, Хибинский пр-д д.2